本周分享文献：Moleculardiagnosticsforcongenitalheartdisease:anarrativereviewofthecurrenttechnologiesandapplications，于年9月发表在JournalofBio-XResearch上。本文主要对先天性心脏病的分子诊断技术及其临床应用进行综述。
背景介绍
先天性心脏病（Congenitalheartdisease,CHD）是在新生儿出生缺陷中最常见的一种疾病，发病率约为1%。在中国，每年有超过13万的人被确诊为CHD。尽管CHD的致病机制复杂且异质性强，但越来越多的证据表明遗传因素在CHD的发病中具有重要作用。
根据美国心脏协会年发表的最新声明指出，3~5%的CHD是由单基因变异引起，8~10%的CHD是由染色体非整倍体引起，3~25%的综合征型CHD和3~10%的单一CHD由拷贝数变异（CNVs）引起。因此，分子诊断技术在CHD的临床诊疗中具有重要作用。
本文就目前CHD的分子诊断技术研究进展及其临床应用进行了综述，并对应用新型基因组检测技术解决CHD的临床诊断难点及未来的发展方向进行了探讨。
分子诊断技术
荧光原位杂交（FISH）
荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是一种高分子识别技术，可以识别与探针互补的目标序列。FISH利用荧光基团标记的核酸探针来实现与目标DNA/RNA序列的结合。
目前，市面上可用于检测CHD的FISH探针通常侧重于22q11微缺失和非整倍体。对于具有典型临床症状和已知致病机制的综合征型CHD来说，相比传统核型分析，FISH具有更高的诊断率和临床效应，且性价比也更高。Cuturilo等人对57例疑似DiGeorge综合征患者进行FISH检测，发现其中24例为22q11.2微缺失阳性，诊断率为42.1%。然而，FISH只能检测已知的致病性基因组区域或基因座。
染色体芯片分析（CMA）
染色体芯片分析（chromosomalmicroarrayarray,CMA）是一种在全基因组范围内检测拷贝数变异的技术，检测平台分为比较基因组杂交（aCGH）和单核苷酸多态性（SNP），其分辨率为50~kb。
年，美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）推荐将CMA技术作为具有多重异常的先天性畸形患者的一线诊断方法。在对例CHD患者的回顾性分析中发现，CMA对综合征型CHD的诊断率为14.11~20.56%，对单一CHD的诊断率为4.32%~9.26%。
因此，相对于核型分析和FISH而言，CMA是临床诊断CHD强有力的工具，但CMA也存在一定局限性，如无法检测单核苷酸变异（SNV）、小片段插入和缺失以及平衡的染色体重排。
靶向测序
靶向测序（Targetedsequencing），基于下一代测序用来检测与疾病或表型相关的目标基因或基因组区域的变异信息。相对于全外显子组测序（wholeexomesequencing,WES）而言，靶向测序具有变异位点筛选和优先排序简单，周转时间更短，偶然发现率低，覆盖率高等优点。
对于单基因型CHD的患者，包括努南综合征或马凡综合征，靶向测序的诊断率高达80%-90%。此外，靶向测序可以作为一种高性价比的检测工具用于临床评估家族性CHD。Blue等人对16个具有CHD家族性病史的家庭进行了CHD相关基因检测，发现了5个与疾病表型分离相关的致病性变异，诊断率为31%。
虽然靶向测序有诸多好处和优势，但在临床应用和CHD研究中仍存在局限性。首先，靶向测序中的基因包需要定期更新，以反映发现的新的CHD致病性变异，否则在进行数据分析和诊断时就有可能丢失某些重要的基因信息。其次，基于靶向测序数据预测CNV的准确性不如WGS，需要进一步验证。最后，对靶向测序数据的重分析无法提供有关CHD患者遗传病因的新信息。
全外显子组测序（WES）
全外显子组测序（wholeexomesequencing,WES），对基因组内的蛋白质编码区域进行测序分析，可检测出大多数已报道的CHD相关致病性变异，包括热点变异和罕见变异。
WES是CHD和非特异性临床表型患者的强大诊断工具。Li等人对例先天性心脏左侧病变患者进行WES检测，发现49人中存在致病性变异，诊断率为14.3%。此外，WES也是一个发现新发变异的强有力工具。Fotiou等人对例非综合征型CHD患者的CNV数据和例法洛氏四联症患者的WES数据进行整合分析，发现了54个新的疾病候选基因。然而，WES无法检测与CHD相关的结构性变异，如倒位和易位。
全基因组测序（WGS）
全基因组测序（wholegenomesequencing,WGS）是一项可检测编码和非编码区域的测序技术，人类基因组覆盖率达98%。WGS能够检测整个基因组的所有的遗传变异类型，包括SNVs、Indel、CNVs和结构变异。因此，WGS可提高CHD的临床诊断率。Alankarage等人对97例CHD患者进行WGS检测，诊断率为31%。此外，WGS还可以揭示CHD的基因组结构变异和致病机制。总的来说，在CHD的临床诊断中，WGS可显著扩大基因组的覆盖范围，有效推动发现新的CHD致病机制。
临床应用建议
目前，分子诊断已被整合到CHD的临床常规诊疗中，并在CHD的亚型分类、预测预后及治疗监测中起着重要作用。对于每一位CHD患者，临床医生应在初步评估(包括体格检查、超声评价、既往实验室检测结果)的基础上，为其选择最合适的分子诊断技术，如图1所示。选取哪种检测技术最合适取决于患者的临床表现和社会经济情况。
图1CHD的临床分子诊断策略
年，ACMG发布了序列变异解读的标准和指南，但目前对检测发现的变异的致病性分类并不能百分之百确定。原因如下：
首先，疾病的临床表型受多种因素影响，包括外显率、表达率、基因组印迹、基因修饰和随机效应等。因此，遗传变异可导致一系列的表型（不同程度的表现度），而疾病发生的几率可能不是%。
其次，基因型和表型之间的复杂关系阻碍了病因学的分析，尤其是涉及遗传修饰因子的CHD单基因遗传和多基因遗传。
最后，对于临床意义不明的变异（VOUS），由于缺乏科学依据，VOUS是否与CHD相关取决于临床医生的判断。
未来展望
人群和疾病数据库是CHD分子诊断的重要工具。现行的千人基因组计划包含了来自26个种族的个个体的遗传变异信息，然而，由于样本量有限，导致无法识别特定群体中的罕见和低频变异。
基因云计算平台的出现则为开发更大的基因组和表型数据库提供了可能，可整合来自不同人群的所有可用的内部数据库。集中存储和大数据处理将最大程度地提高CHD基因检测的效率，并有助于将数据有效地转化为个体化医疗。
随着人工智能（AI）的出现，尤其是深度学习算法和图形处理单元的发展，将快速推动分子诊断的应用。在可预见的未来，AI在临床基因组学中的应用将显著提高CHD的分子诊断水平。
正如上述所说，目前CHD的分子诊断结果可能并不意味着%准确。但是，随着人群数据库的扩大，AI分析策略的优化，CHD表型-基因型数据的积累，以及测序价格的下降，在不久的将来分子诊断技术将改变CHD的诊疗方式。
参考文献：
ZuB,ZhengZ,FuQ.Moleculardiagnosticsforcongenitalheartdisease:anarrativereviewofthecurrenttechnologiesandapplications[J].JournalofBio-XResearch,,3(3):92-96.
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