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复医院始建于年，是一所集医疗、教学、科研医院，因创建时英文名称为MargaretWilliamsonRedHouseHospital，被大家亲切地称为“医院”。近日，医院遗传中心主任徐晨明教授和团队在BMJOpen杂志上发表了一项多中心前瞻性临床研究的研究方案，计划招募至少名高风险孕妇，以评估单基因病等遗传性疾病无创产前检测的性能。为此，转化医学网邀请到了徐晨明教授，她为我们详细介绍了该项目的情况和单基因病无创产前检测的研究进展，并分享了她对无创产前检测未来发展的一些思考，以下为访谈内容。
问
徐教授您好！最近，您和团队在BMJOpen杂志上发表了一项多中心前瞻性临床研究的研究方案。这个新项目是针对遗传病高风险孕妇的全面无创产前筛查。目前的无创产前筛查都是针对胎儿染色体异常，您们的临床研究项目包含了单基因病，这是一个新亮点。但单基因病无创产前筛查是个很新的方向，这一领域目前的研究进展如何？
答
事实上，单基因病的无创产前检测研究起步很早。年发现孕妇外周血存在胎儿游离DNA后，年就有研究者利用胎儿游离DNA检测强直性肌营养不良。早期单基因病无创产前检测通常用于检测单个点突变，比如导致软骨发育不全的FGFR3基因的热点突变，最早是使用RFLP分子标记间接检测。由于单基因病的复杂性和检测技术的局限性，单基因病无创产前检测无法像染色体非整倍体一样迅速流程化并应用于临床，多年来只有一些实验室研究成果。直到年，英国国家医疗服务体系（NHS）批准了软骨发育不全和致死性骨发育不良等疾病的无创产前辅助诊断，这是单基因病无创产前检测首次被用于临床。随着测序技术的迅猛发展，二代测序实现了多个基因多个变异的同步检测。年，美国BaylorGenetics发布了无创产前多基因检测产品PreSeek，可一次检测30个基因，44种显性单基因病。年，华大基因的全因2.0可以通过ddPCR技术检测软骨发育不全。
我们的临床研究项目采用靶向捕获高通量测序技术，采集入组的高风险孕妇的外周血样本并提取游离DNA，探针杂交液相捕获建库后上机测序，检测75个基因种显性单基因遗传病，并用随访结果比较验证。毫无疑问，单基因病是无创产前筛查发展的新方向。
问
看起来，单基因病无创产前检测的研究超过20年了，为什么当前还没有规模化临床应用呢？是因为单基因病的发病率很低？还是因为技术上难以实现？
答
单基因病种类繁多，全部多种单基因病的综合发病率很高，超过了1%。但单个单基因病的发病率通常较低。除了常见高发的，绝大多数单基因病的发病率低于十万分之一。无创产前筛查单个单基因病，临床意义有限，所以需要对更多疾病组合检测，这大大提高了技术的难度。当然，筛查的疾病数量也不是越多越好，要技术可行性和临床适用性相结合。最好是选择发病率高、表型严重、基因和疾病关系相对明确的常见高发疾病组合筛查。例如，BaylorGenetics的PreSeek检测30个基因，44种单基因病，综合发病率约1/。我们的临床研究项目里有75个基因，计算的综合发病率约1/（值得一提的是，我国很多单基因病没有准确的发病率数据，这一情况也将随着单基因病无创产前筛查的临床普及而得到改善）。再添加检测基因和疾病数量，对综合发病率的增加非常有限，但检测成本和对临床遗传咨询的压力可能急剧增加。因此，我们认为筛查种左右常见显性单基因遗传病是最适宜的。总结一下，多种单基因病的产前筛查综合发病率并不低，临床意义也很明确。目前没有广泛临床应用，主要还是因为研发难度大，技术上比无创产前检测染色体异常难度要高出很多。
问
那么，单基因病无创产前检测的技术难度体现在哪些方面呢？和目前主流的NIPT在检测内容和检测技术上有什么区别？
答
前面说到准确检测约种常见显性单基因遗传病是最适宜临床的。而当前能有效满足这个要求的，最好的就是NGS技术平台。NIPT和NIPTplus，通常使用的是低深度全基因组测序，无法检测单个基因的单碱基突变或小的插入/缺失；而高深度的全基因组测序，不具备临床适用性。因此，靶向测序是可行的解决方案。多重PCR后高通量测序理论上也可以用于单基因病筛查，但实际上，对于单个突变位点，如果这个引物不合适或优化得不好造成对目标片段的脱扣，就可能造成漏检。尽管存在突变热点，单基因病的检测必须覆盖全部外显子、剪接区域甚至部分内含子区域。因此扩增子靶向高通量测序，也不是单基因病产前筛查的优选方案。所以技术方案上已经没有其它选择：探针捕获靶向高通量测序是目前最优方法。
此外，单基因病无创产前检测的技术难点还体现在以下三个方面。一是湿实验，重点是杂交捕获建库，包括探针的设计，成千上万条探针，如何保证相对一致的杂交捕获效率？很难。NIPT低深度全基因组测序，某个片段没检测到，并不影响染色体拷贝数的计算，但单基因病不行，没检测到就漏检了。第二个难点是干实验即生信算法，这个与NIPT是完全不同的。如何保证在低胎儿cfDNA浓度下，如4%时，还能准确识别胎儿的突变位点？新发突变，母亲这个位点正常，胎儿突变就只占到这个位点的2%了，这对检测的精密度和重复性要求很高。准确检测低丰度突变对生信算法的要求不低。第三，非常重要的是，单基因病无创产前筛查检测到的变异位点需要通过公共数据库查阅和文献调研，结合具体病例进行人工解读，按照《ACMG遗传变异分类标准与指南》，将变异分为致病性、疑似致病性、临床意义不明、疑似良性、良性五级。这对研究团队的遗传学背景和临床知识都有较高的要求。本地数据库积累的病例越多，对人工的依赖就会越小，能显著提高效率并减少人为错误。这个数据库以后也会成为一个很大的壁垒，先发者优势会更加明显。看看所有的关键词：多种基因、多种疾病、基因全覆盖、探针、杂交捕获、cfDNA、点突变、本地数据库、解读等等，组合在一起，就是单基因病无创产前检测的技术高度和难度。这些问题都解决之时，就是其广泛临床应用的开始。目前来看，我们正在进行的临床研究的检测技术，把这些问题都圆满地解决了。
问
徐教授，您多次提及显性单基因遗传病。这次的多中心前瞻性临床研究，对单基因病，只筛查了显性遗传病吗？为什么呢？
答
是的，我们正在进行的临床研究项目，所包含的单基因病，都是主要由新发突变导致的显性遗传病。这是出于以下两点考虑：一是临床意义和需求紧迫度。显性单基因病约占全部单基因病的一半，大多数显性单基因病是由新发突变导致的。对于由新发突变导致的表型严重的显性单基因病，检测父母无法预测胎儿的患病风险，因此孕前的一级预防无法解决，产前是筛查并阻断的唯一时间节点。新发突变具有一定的偶然性，父母年龄是新发突变目前已明确的风险因素之一。新生儿携带的新发突变的数量会随着父母年龄增大而增多。高龄产子尤其是父亲高龄将增大胎儿患新发突变疾病的几率。伴随三胎*策放开，高龄产子导致胎儿患遗传性疾病风险升高的形势将更为严峻。因此，非常有必要对由新发突变导致的显性单基因病进行产前筛查。二是技术难度。隐性单基因遗传病的无创产前筛查，比显性遗传病新发突变的筛查更加复杂、难度更大，目前全球都没有很好地解决这个问题。对隐性单基因遗传病，现在临床还有间接筛查方案。国内外近年来兴起的扩展性携带者筛查（ECS），就是筛查父母本人的隐性单基因遗传病携带情况，间接评估胎儿的患病风险以决定是否进行产前诊断。但对于众多显性遗传病，直接在孕早期用胎儿游离DNA去做无创筛查是最佳方法。
问
在您们这次临床研究方案里，只入组了高风险孕妇。是单基因病无创产前检测只适合高风险孕妇吗？哪些人群是高风险呢？
答
单基因病无创产前筛查并不是只能应用于高风险孕妇。年Nature发表的一项研究表明，每个人平均携带约70个新发突变；新生儿携带的新发突变的数量会随着父母年龄增大而增多。母亲年龄每增长一岁，胎儿可获得的新发突变就会增加0.37个，父亲的年龄每增长一岁，胎儿获得的新发突变则增加1.51个。由此可见，任何胎儿都存在新发突变的风险。此外，由于这些显性单基因遗传病的综合发病率达到了1/，所以这项单基因病无创产前检测适用于所有孕早期孕妇的普筛。但是，我们这次的前瞻性临床研究选择了高风险人群，是希望能用更少的标本和更短的时间去评估检测的性能。入组孕妇首先必须满足孕周≥12+0周和单胎妊娠的基本条件。不同孕周有不同的高风险指标，符合其中一条即可入组：（1）12-16周的NT异常增厚或淋巴水囊瘤、心脏结构缺陷或鼻骨缺如或发育不全；（2）17-21周的多囊肾、宫内生长受限、消化道畸形、脑室增宽、羊水过多/过少、肠回声或肾盂分离；（3）22周及以上的长骨的长度形状矿化程度异常、手指和脚趾数目异常、手掌和脚掌形态异常、头，腹部和胸部的周长异常、颅骨，脊椎的异常矿化和形态异常、肩胛骨，锁骨，前额，鼻骨，下颌骨的大小和形态异常、四肢姿势异常等。这些高风险孕妇基本都存在产前诊断的指征，在产诊前抽取孕妇外周血，盲法进行单基因病无创产前筛查，并将检测结果和随访结果比对研究。
问
这个多中心前瞻性临床研究的项目进展如何？
答
这项前瞻性临床研究参与单位包括复医院、浙江省妇幼保健院、湖南省妇幼保健院和博昊基因，项目的PI是*荷凤院士。医院伦理批准后，今年4月通过了人类遗传资源采集审批、6月通过中国临床注册中心注册审批。我们计划在三家产前诊断中心收集样本，招募至少名高风险孕妇，将检测结果与产前或产后诊断检测等随访结果进行比较，评估单基因病无创产前检测的性能。
该项目目前进展顺利。入组、实验、分析、数据解读和随访流程都已确定并运行良好，已经入组了多份样本。我们将在项目结束后报告研究结果。从目前数据来看，这项单基因病无创产前筛查在高风险孕妇中阳性检出率为5%，所有已随访结果都与检测结果一致。
问
您认为单基因病无创产前筛查以后会成为主流筛查项目吗？
答
NIPT经过多年推广，已经得到了广泛应用和认可。去年，美国将NIPT的适用人群，从高风险孕妇推广到所有孕妇。中国NIPT的渗透率应该已经超过了35%。但NIPT只筛查染色体异常，不能解决单基因病的问题，所以单基因病的无创产前筛查，一定是产筛的正确发展方向。只要解决了常见高发的多病种筛查技术难题和报告解读问题，且回顾性和前瞻性临床研究证实检测准确可靠，我相信一定也可以得到临床的认可和规模化应用。
问
您认为无创产前检测下一步会如何发展？
答
相对突变剂量（RMD）和相对单体型剂量（RHDO）是目前单基因病无创检测的两种方案，前者可直接检测突变，在检测技术足够精确的条件下，多数单基因病都可以检测；后者在检测复杂区域和复杂突变时有优势，可以弥补RMD的不足，但RHDO需要分析先证者和父母的SNP来取得父母的单体型，如果采用三代测序等技术，不用再分析父母的单体型，直接分析胎儿的单体型，有可能会是个好的方向。
更重要的是，技术上去攻克隐性单基因病的无创产前筛查难关，实现单基因病筛查病种的合并，无需先证者和父亲样本，同步筛查显性和隐性遗传病。再进一步，通过无创产前检测技术可以同时检测染色体非整倍体、染色体微缺失/微重复和单基因病，一次采集孕妇外周血就可完成对所有常见变异的同步检测，真正实现孕妇的全面无创产前筛查。随着测序技术的进步和测序价格的下滑，不排除通过孕妇外周血胎儿游离DNA，直接做医学全外或全外显子检测，这种无创WES，或许数年后可能用于临床。
结语：非常感谢徐教授接受转化医学网的专访，期待您们的前瞻性临床研究早日圆满完成，也共同见证单基因病无创产前筛查临床应用时代的到来。
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徐晨明教授
复医院遗传中心主任
年获浙江大学生命科学学院遗传学硕士学位，年获浙江大学医学院妇产科学博士学位，年度获教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队骨干成员资助，曾作为访问学者赴香港大学医院和澳大利亚医院进行临床科研交流。历任浙医院生殖遗传科主任、上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院生殖遗传科主任，兼任中国医师学会医学遗传学分会委员、中华医学会医学遗传学分会细胞遗传学组委员、中国遗传学会遗传诊断分会委员、中国优生科学协会理事、上海市医学会分子诊断分会委副主任委员、上海市遗传学会遗传与分子诊断专业委员会副主任委员等。